溴化氰生产企业为进一步确认溴化氰裂解产物，分别选择rhTNFR和rhNeuregulin的C端肽段进行MS/MS分析。与MALDI/TOFMS不同，分子量在700Da以上的肽段在电喷雾质谱中很容易形成多电荷离子。因此选择rhTNFR中m/z716.33三电荷离子进行MS/MS分析。结果表明：其C端19个氨基酸与理论序列完全一致。实验选择rhNeuregulin中m/z674.87双电荷离子进行测序，结果表明：其C端11个氨基酸序列与理论序列一致。如图2和图3分别是rhTNFR和rhNeuregulinC端的MS/MS图。

  溴化氰的生物质谱，尤其是电喷雾串联质谱的出现，为蛋白质及多肽的测序开辟了一条新途径，成为鉴定微量蛋白质及蛋白质翻译后修饰的有力工具。串联质谱法测定蛋白质C端序列将完整的蛋白用酶切或化学裂解方法切割为适合串联质量测序的肽段。对于序列已知的蛋白质，可根据序列和酶切位点计算出C端肽段的理论分子量，然后选择对应分子量的肽段进行测序以确证C端序列的正确性。

  溴化氰能够选择性地裂解由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键，对于大多数蛋白质裂解效率为90%以上。研究人员首次建立了将溴化氰裂解和羧肽酶酶切相结合，然后通过MALDI-TDF-MS测定蛋白质C端序列的方法。如果蛋白质或多肽中靠近C末端的甲硫氨酸位置在第10到50个之间，则裂解下来的肽段就适合用串联质谱测序。尽管甲硫氨酸在蛋白中出现的频率不高，但研究人员的研究表明，沙雷菌蛋白中靠近C末端第一个甲硫氨酸位置在第10到50个之间的频率约为50%。

  由rhTNFR的C端序列可知，倒数第3个氨基酸为脯氨酸，因此该蛋白不适合用化学法测定。另外，该蛋白的倒数第9个氨基酸为赖氨酸，理论上用胰蛋白酶酶切后的肽段可用于ESI-MS/MS测序，但经胰蛋白酶酶切后进行ESI-MS-MS分析时并没有找到该肽段。

  本实验应用溴化氰裂解结合ESI-MS/MS分析得到了该蛋白质的C端序列并证明了其C端的赖氨酸缺失。说明这是一种蛋白质C端测序的很好的方法。由于蛋白质中甲硫氨酸的数量较少，因此溴化氰裂解的优点是产生的肽段较少，C端肽段很容易辨认。

  值得指出的是，从图1和图1可以看出，溴化氰裂解后的C端肽段均为基峰，这很有利于进一步测序。此方法的灵敏度很高，rhTNFR仅用2ug，约40fmol即可检测到其C端序列，这是其它方法所到不到的。该方法的局限性在于对氨基酸序列有一定的依赖性，尤其是甲硫氨酸在蛋白中距离C端的位置。